外泌體科普系列（二）： 外泌體：極具潛力的納米級藥物遞送系統
外泌體（exosomes）作為信號分子的天然載體，具有藥物遞送、疾病治療的應用潛能。外泌體具有囊泡結構，其膜上和內部均可攜帶各種分子，并且通過融合、吞噬、或識別結合受體來將有效載荷（payloads）傳遞給目標細胞。研究表明，天然外泌體能夠裝載核酸（如mRNA、miRNA、siRNA、lncRNA和DNA）、蛋白質、代謝物等。以此為啟發，人們著力于開發外泌體在疾病治療上的潛力。
(Barile and Vassalli, 2017)
mRNA:
早在20世紀90年代，研究者就提出利用治療性mRNA(therapeutic mRNAs)翻譯產生蛋白質來進行疾病治療。然而這種mRNA依賴的治療（mRNA-based therapy）面臨著兩個重要的挑戰。一是mRNA分子自身的不穩定性（instability）；二是外源轉錄mRNA（in vitro-transcribed mRNA，IVT）的免疫原性（Immunogenicity）。為了降低mRNA的免疫原性，研究者使用人工合成的帶修飾的核苷酸生成mRNA, 如m6A, Ψ, m1Ψ, 5mC, 5hmC，5moC，2FdU和2FdC 修飾等。在此基礎上，用外泌體包裹mRNA作為給藥載體，具有諸多優勢。首先，mRNA被包裹在外泌體內，有效地避免了降解；然后，外泌體在體液中運輸，利用其自身靶向特點識別目標細胞，使mRNA精準有效地呈遞到目標細胞，并進一步發揮治療功能。例如，外泌體負載mRNA呈遞系統已經被用于治療帕金森?。≒arkinson’s disease）、乳腺癌（breast cancers）、白血病（leukemia）、膠質瘤（glioma）和神經鞘瘤（schwannoma）等。研究者設計了EXOtic系統（EXOsomal transfer into cells），在HEK-293T細胞中生產外泌體，并將catalase mRNA裝載入外泌體，并運輸到大腦，有效降低帕金森病中的神經炎癥（neuroinflammation） (Kojima, Bojar et al. 2018)。另外，研究者使用EXO-DEPT體系運載HChrR6 mRNA靶向具有HER2受體的癌細胞，來治療乳腺癌 (Forterre, Wang et al. 2020)。同時，利用裝載Cas9 mRNA 和靶標mir-125b-2 位點gRNA的外泌體來治療白血病(Usman, Pham et al. 2018)；利用裝載PTEN mRNA (phosphatase and tensin homolog)的外泌體來治療膠質瘤(Yang, Shi et al. 2020)；利用裝載CD-UPRT mRNA的外泌體來治療神經鞘瘤等。
(Aslan, Kiaie et al. 2021)
miRNA和siRNA
RNAi是指由小RNA如siRNA或miRNA介導的基因沉默。近年來，RNAi治療日益凸顯其優勢。首先，siRNA或miRNA通過堿基互補配對能夠特異高效地結合靶標，對其進行沉默；另外，在實踐過程中，siRNA或miRNA序列長度短，穩定性更高。在發展RNAi治療的過程中，小RNA的運輸一直是一個關鍵問題。小RNA是親水性的帶負電的分子，不能穿透細胞膜，并且易被RNase降解，因此需要高效安全的運輸體系使其準確有效地進入目標細胞。外泌體作為載物平臺具有良好的輸送效率、膜滲透能力、非免疫原性及毒性，因此是高速發展的
小RNA遞送平臺。到目前為止，許多研究已經采用外泌體作為小RNA的載體來治療各種疾病，特別是腦部疾病和腫瘤。外泌體能夠穿越血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），經常被用來作為小RNA運載平臺來治療神經系統疾病（Neurological disorders）。例如，通過RVG-exosome系統運輸靶向BACE-1的siRNA ，降低BACE-1的表達，來治療阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer's disease）(Alvarez-Erviti, Seow et al. 2011)；運輸靶向MOR的siRNA，降低MOR的mRNA和蛋白質水平，治療嗎啡復吸（Morphine relapse） (Liu, Li et al. 2015)；研究者利用從由間充質干細胞（mesenchymal stem cells）衍生的外泌體負載靶向KrasG12D的siRNA，治療IV期胰腺癌患者（NCT03608631）(Kamerkar et al., 2017)。來源于骨髓基質細胞（ marrow stromal cells，MSC）的外泌體攜帶 miR-146，通過抑制膠質瘤異種移植生長（Glioma xenograft growth), 治療原發性腦瘤 (Katakowski, Buller et al. 2013)。另外，外泌體運載小RNA還被廣泛用于治療腫瘤(tumors)，比如運載Let-7a miRNA，靶向HMGA2和RAS基因家族，抑制腫瘤生長 (Ohno et al., 2013)；運載靶向TGF-β1的siRNA的外泌體，可以用來抑制腫瘤細胞的生長和轉移(Zhang et al., 2014)。除此之外，外泌體運載的多種siRNA或miRNA也被廣泛用在治療眼部疾病、腎病和肝病等等。
(Lu, Xing et al. 2018)
蛋白質
除了眾多治療性RNA外，治療性蛋白質也能夠被裝載入外泌體中，用于疾病治療，通常為以下四種方式。第一種，細胞質蛋白在外泌體自然形成的過程中被包裹裝載；第二種，細胞質蛋白被包裹裝載在人為設置尺寸的“人工外泌體”中；第三種，治療性蛋白與外泌體膜蛋白融合，從而被裝載；第四種，治療性蛋白與細胞膜蛋白融合，并且加上寡聚信號（oligomerization signal）幫助裝載入外泌體。如此，外泌體裝載治療性蛋白質具有穩定性好、特異性強的優勢。例如，Schwannomas是由脫分化的Schwann細胞沿著周圍神經生長出的良性腫瘤，壓迫神經導致疼痛、虛弱、癱瘓或聽力喪失。通過293T細胞，將胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase，CD）和尿嘧啶核苷酸轉移酶（uracil phosphoribosyltransferase，UPRT)裝載入外泌體，通過抑制目標細胞DNA合成，從而有效殺死腫瘤細胞 (Mizrak et al., 2013)。另外，caspase-1 也被報道可以裝載入外泌體，引起靶標細胞死亡，從而治療腫瘤。外泌體裝載蛋白作為疾病治療手段正在迅猛發展，具有重大意義。
(Hall et al., 2016)
疫苗
疫苗對人類的重要性不言而喻。疫苗是利用細菌、病毒、腫瘤細胞及代謝產物等制成的可使機體產生特異性免疫反應的生物制劑。疫苗的制備方式多種多樣，有利用病原微生物滅活后保留全微生物體做成的滅活疫苗，類毒素疫苗，利用病原微生物表面的有效抗原制備的亞單位疫苗，核酸疫苗（mRNA和DNA疫苗）以及載體疫苗等。對于載體疫苗，目前已開發出許多種類的載體，包括人造顆粒（金、聚合物、脂質膠束）和生物顆粒（核酸、蛋白質、病毒）。目前迅速發展的以外泌體作為疫苗載體具有許多優勢。外泌體能夠穿越血腦屏障，高效安全地運輸，然后被目標細胞特異性識別。早在2000左右，研究者就報道了外泌體作為疫苗載體地第一個臨床試驗結果。到現在，許多基于外泌體載體的候選疫苗正在快速開發中，比如一些用于治療癌癥、艾滋病、乙肝和其他傳染病等的疫苗。近年來，新冠疫情肆虐，針對COVID-19的疫苗開發重要且緊迫。目前，以外泌體為載體的新冠疫苗已有數十種處于臨床研發狀態（ ClinicalTrials.gov）。例如，處于臨床I期 (NCT04747574) 和臨床II期（NCT04902183）的CD24疫苗；來源于骨髓間充質干細胞（bone marrow MSC）外泌體裝載的疫苗(NCT04602442， NCT04276987，NCT04798716，NCT04491240)；來源于T細胞外泌體裝載的COVID-19疫苗（NCT04389385）等等。到目前為止，研究者針對外泌體裝載疫苗已經有諸多關于其安全性和有效性的臨床試驗結果，而關于外泌體裝載疫苗的具體給藥劑量還需要更多的研究，以更好的誘導機體免疫原性或長期記憶反應，以到達預防新冠病毒的目的。
(Santos and Almeida, 2021)
綜上，外泌體負載生物分子并在細胞間穿梭交流的特性，展現出高效特異呈遞生物分子的潛力，逐漸發展成疾病治療的一個重要手段。眾多外泌體裝載的治療性藥物和疫苗還處于臨床試驗階段，擁有巨大的發展機遇，值得大力推進。
(Perocheau et al., 2021)
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